4.2.4 VECTORES DE CLONACIÓN

4.2.4. VECTORES DE CLONACIÓN

Los vectores de clonación son moléculas transportadoras que transfieren y replican fragmentos de ADN que llevan insertados mediante técnicas de ADN recombinante. Para que sirva de vector, una molécula debe ser capaz de replicarse junto con el fragmento de ADN que transporta. También tiene que tener secuencias de reconocimiento que permitan la inserción del fragmento de ADN a clonar.

Para insertar un fragmento de ADN al vector, se utiliza una enzima de restricción, y se mezcla con fragmentos de ADN producidos con la misma enzima.

Los vectores que transportan un fragmento insertado se denominan vectores recombinantes

Tipos de vectores

Hay muchos vectores de clonación, que difieren en la especificidad de la célula huésped, el tamaño de los insertos que pueden transportar y en características como el número de copias que producen y el número y tipo de genes marcadores que contienen, entre otras.

Plásmidos

Los plásmidos fueron los primeros vectores que se desarrollaron, y aún son ampliamente usados. Estos vectores proceden de moléculas de ADN de doble cadena extracromosómicas que se encuentran de manera natural y que se replican autónomamente dentro de las células bacterianas.

pUC18

Es un plásmido muy utilizado, ya que presenta unas características que son muy beneficiosas:

- Es pequeño, de modo que puede transportar fragmentos de ADN relativamente grandes (de unos 10.000 pares de bases).

- Tiene un origen de replicación y puede producir hasta 500 copias de los fragmentos de ADN insertado por célula.

- Se ha modificado para que presente muchas secuencias de reconocimiento para enzimas de restricción que se han agrupado en una región denominada polylinker o multiple cloning site.

- Permite la identificación sencilla de los plásmidos recombinantes, ya que contiene un fragmento del gen bacteriano lacZ que produce colonias de color azul. Si se inserta un fragmento de ADN en el polylinker, se inactiva este gen, y da lugar a colonias de color blanco.

Bacteriófago lambda

El genoma del fago lambda se ha cartografiado y secuenciado completamente. Para ser utilizado de vector, el tercio central de su cromosoma puede ser reemplazado por ADN foráneo, sin que ello afecte a la capacidad del fago de infectar células y formar cápsides.

Para clonar ADN utilizando este vector, se purifica el ADN del fago y se corta con una enzima de restricción, con la misma enzima de restricción cortamos el fragmento de ADN de interés y los unimos con una ADN ligasa. Los vectores lambda recombinantes se empaquetan in vitro en las cápsides proteicas del fago, y se introducen en células huesped bacterianas. Dentro de las bacterias, los vectores se replican y forman muchas copias del fago infectivo, llevando todas ellas el fragmento de ADN de interés en la clonación. Los vectores fágicos pueden transportar fragmentos de hasta 20 kb ( kilobases).

Cósmidos

Los cósmidos son vectores hibridos utilizando partes del cromosoma de lambda y de plásmidos. Tienen la secuencia cos del fago lambda, necesaria para el empaquetamiento del ADN del fago dentro de su cubierta proteica, además contienen secuencias plasmídicas necesarias para la replicación y genes de resistencia a antibióticos. Los cósmidos pueden transportar casi 50 kb de ADN insertado.

YAC

Los YAC son cromosomas artificiales de levadura. Un YAC tiene telómeros en sus extremos, un origen de replicación y un centrómero. Estos componentes están unidos a genes marcadores de selección y a un grupo de enzimas de restricción para insertar ADN exógeno.

Estos cromosomas artificiales de levadura permiten clonar grandes trozos de ADN, de 100 a 1000 kb.

BAC

Un BAC es un cromosoma artificial bacteriano, basado en el plásmido de fertilidad ( factor F ) de bacterias.

El factor F es un plásmido que se replica independientemente y que transfiere información genética durante la conjugación bacteriana.

Los BAC pueden transportar insertos de hasta 300 kb.