martes, 30 de octubre de 2012

2.1.5 PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO


2.1.6 preparación de los medios de cultivo

La preparación adecuada de un medio de cultivo nos permite disponer de los nutrientes y condiciones necesarias para favorecer el crecimiento de los microorganismos en el laboratorio.

Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes básicos, o por simple rehidratación de productos asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados). Generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque, además de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles.


Para su preparación se deben tener en cuenta los siguientes aspectos:

• Prepararlos sólo a partir de productos que provengan de fabricantes o proveedores que suministren productos de calidad.
• Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiológica y fisicoquímica adecuada.
• Utilizar materiales de vidrio bien lavados y enjuagados con agua destilada o desmineralizada.
• Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilización. Nunca se deben exceder las condiciones señaladas por el fabricante.


ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases sellados bajo las condiciones que señale el fabricante. Generalmente se almacenan en un lugar fresco (entre 15 y 25°), con poca humedad y protegidos de la luz solar directa. Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra fuente de calor o vapor.

Los medios de cultivo deshidratados son higroscópicos. Cuando los envases de estos medios de cultivo deshidratados son abiertos para su uso inicial, se debe tener la precaución de cerrarlos tan pronto como sea posible y mantenerlos bien cerrados para prevenir la entrada de humedad. La absorción de agua produce cambios de pH, formación de grumos, decoloraciones del polvo, etc., lo cual indica que deben ser descartados porque pueden haber sufrido cambios químicos o estar contaminados.

Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado, puede almacenarse a temperatura ambiente por un periodo máximo de 2 semanas protegido de la luz, o por periodos mayores a 12 -15ºC. Sin embargo, almacenados bajo refrigeración entre 2 y 8°C se prolonga la vida útil de los mismos, (nunca por debajo de 0ºC porque se destruye la estructura del gel). Los medios de cultivo se deben mantener en recipientes bien cerrados para evitar su deshidratación y cuando se usa tapón de algodón, se debe colocar por encima una envoltura de papel (Craft).

Otro punto importante a tomar en cuenta, es que cada lote de medio de cultivo preparado debe pasar por un riguroso proceso de control de calidad, en donde se determinan sus propiedades fisicoquímicas (apariencia, pH, etc.) y microbiológicas (esterilidad y promoción de crecimiento) verificando que cumplan con los requisitos de calidad establecidos y por ende demostrar que son aptos para su uso.

 

 

PROCEDIMIENTO

1. Leer cuidadosamente las instrucciones de preparación del medio de cultivo asignado.

2. Pesar la cantidad exacta del medio deshidratado o las porciones correctas de cada uno de los ingredientes.

Cerrar inmediatamente el frasco de medio de cultivo.

3. Disolver la porción pesada de acuerdo con las indicaciones del fabricante.

Si es necesario calentar se debe tener cuidado de no sobrecalentar.

4. Ajustar el pH final de cada lote de medio preparado, preferiblemente a temperatura ambiente (25°C).

Para ello se debe tomar una alícuota de 50 mL, medir el pH y de ser necesario

ajustar al pH indicado utilizando HCl 0,1N o NaOH 0,1N. Luego hacer el ajuste de

pH al resto del medio de cultivo utilizando la solución correspondiente pero 1 N.

5. Distribuir el medio de cultivo de acuerdo a las indicaciones señaladas por el profesor.

6. Identificar el lote de medio de cultivo preparado indicando su nombre, distribución

y fecha de preparación.

7. Esterilizar de inmediato el medio de cultivo siguiendo las instrucciones señaladas

en el trabajo práctico N° 8.

Si se presenta algún inconveniente que impida su inmediata esterilización, el medio de cultivo se puede almacenar por un periodo máximo de 12 horas bajo refrigeración.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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2.1.2 PREPARACION Y MANEJO DE SOLUCIONES STOCK

2.1.2 preparación y manejo de soluciones stock

Métodos los cuales se mencionan posteriormente estos se indican en la parte de abajo, se utilizan para la preparación de las 4 soluciones que componen al medio de cultivo para la propagación de plantas in vitro es por ello que al momento de querer preparar dicha solución se deben de hacer cálculos dependiendo la cantidad de plantas que se deseen cultivar, de acuerdo a esto mediante los cálculos ya que por medio de estos se indicara cuanto se pesara de cada componente del MS; con el fin de poder obtener un buen manejo y por lo tanto esto permite que se tenga una buena propagación.

Preparación de una solución stock de macronutrientes MS x10 (solución 1)

Por ejemplo para obtener un litro de dicha solución llénese un erlenmeyer de 1 l con 500 ml de agua destilada. A continuación añádase cada uno de sus componentes (Tabla 1) disolviéndolo totalmente antes de añadir para evitar que se hagan grumos y sobre todo para que la solución este bien concentrada en la siguiente tabla se representan las sustancias y el peso en gramos que se le agregara para la preparación de 500ml por lo consiguiente se representa las siguiente cantidades de sustancias o componentes de un MS:

Substancia
Peso (en gramos)
NH4NO3
16,5
KNO3
19,0
CaCl2·2H2O
4,4
MgSO4·7H2O
3,7
KH2PO4
1,7

 

Para finalizar, bastará con verter el contenido en una probeta de 1 l, enrasar con agua destilada, trasladar la solución a su recipiente definitivo y agitarlo dejándolo reposar para su mejor concentración de la solución. Esta solución debe guardarse a 4 ºC en el refrigerador.


Para obtener un litro de dicha solución llenar un erlenmeyer de 1 l con 500 ml de agua destilada. A continuación añadir cada uno de sus componentes (Tabla 2) disolviéndolo totalmente antes de añadir el siguiente.

Substancia
Peso (en mg)
MnSO4·4H2O
2.230,0
ZnSO4·7H2O
860,0
H3BO3
620,0
KI
83,0
Na2MoO4·2H2O
25,0
CuSO4·5H2O
2,5
CoCl2·6H2O
2,5

 

Para terminar, proceder del mismo modo que con la solución stock de macronutrientes. Esta solución también debe almacenarse a 4 ºC.


Para obtener 100 ml de dicha solución deben seguirse los pasos siguientes:

Calentar unos 50 ml de agua destilada en un agitador magnético en dado caso que no se cuente con este material se debe de agitar con una varilla para la disolución uniforme de los componentes vertiéndolos por completo y sobre todo para que no queden grumos, teniendo un preparado para tal propósito.

Cuando el agua esté templada, añadir 556 mg de FeSO4·7H2O.

Una vez se haya disuelto el producto anterior, agregar 744 mg de Na2EDTA·H2O.

A continuación, añadir 1 lenteja de NaOH.

Ya disueltos todos los elementos, verter el contenido en una probeta de 100 ml, enrasar, trasladar la solución a su envase definitivo y etiquetar debidamente. Esta solución se almacena a 4 ºC.


Para obtener 100 ml de dicha solución llenar un erlenmeyer con unos 50 ml de agua destilada y añadir uno a uno, hasta total disolución los siguientes componentes:

Substancia
Peso (en mg)
Mio-inositol
2.000
Ácido nicotínico
10
Piridoxina·HCl
10
Tiamina·HCl
2
Glicina
40

 

A continuación, verter el contenido en una probeta de 100 ml, enrasar, llenar el recipiente definitivo con la solución y etiquetarlo. La solución stock de vitaminas debe almacenarse a -20 ºC.

 

 

 

Componentes de un MS los cuales les proporcionan los nutrientes necesarios para una efectiva propagación de plantas.

SALES MINERALESMS (MURASHIGE AND SKOOG, 1962) (g/l)

(NH4 )NO3 1.650

KNO3 1.900

CaCl2.2H2O 0.440

MgSO4.7H2O 0.370

KH2PO4 0.170 MS X 10

FeSO4.7H2O 0.0278

Na2EDTA. 2H2O 0.0372 MS X 200

MnSO4.H2O 0.0169

ZnSO4.7H2O 0.0086

H3BO3 0.0062

KI 0.00083

Na2MoO4.2H2O 0.00025

CuSO4.5H2O 0.000025

CoCl2.6H2O 0.000025 MS X 100

Mioinositol 0.100

Tiamina HCl 0.0001

Acido nicotínico 0.0005

Piridoxina HCl 0.0005

Glicina 0.002 MS X 200

Sacarosa 30 g.

Agar-agar 2.7 g.

2.1.4.4 COMPLEJOS ORGANICOS


2.1.4.4 complejos organicos

Los metales están de forma natural en el medio ambiente, son aportados a los suelos y al ciclo hidrológico durante la erosión de rocas ígneas y metamórficas por la acción atmosférica física y química. Algunos metales son naturalmente abundantes y tienen altas concentraciones de fondo (e.g. Al, Fe), otros metales son más raros y tienen bajas concentraciones de fondo (e.g. Hg, Cd, Ag y Se).

Definición de metales pesados y su significado

El término “metales pesados” es ampliamente usado por científicos medioambientales y su definición es complicada. Lesaca (1997) incluye en esta definición a los metales que en la tabla periódica están en el rectángulo que forman Ti, Hf, As y Bi en sus esquinas, y además a dos elementos no metálicos: Se y Te.

En general la expresión “metales pesados” se usa cuando hay una connotación de toxicidad. Los metales pesados más comunes por sus efectos tóxicos y porque son fácilmente medibles en muestras marinas son plomo, cadmio, mercurio, arsénico, bario, zinc, cobre, hierro y manganeso (Ansari, 2004).

Generalmente los metales pesados se encuentran en concentraciones muy bajas, aunque la actividad humana ha aumentado sus niveles en muchas aguas fluviales, océanos y sedimentos por: residuos mineros, extracción de petróleo y gas, industrias (pesticidas, pinturas, cuero, tejidos, fertilizantes, medicamentos), vertidos domésticos, residuos agrícolas, etc.

Algunos metales pesados son esenciales para la vida y otros son beneficiosos, pero muchos son altamente tóxicos. Las concentraciones en las cuales los metales pueden ser considerados tóxicos cambian de una especie a otra, para una especie, un elemento es esencial en niveles bajos, puede ser tóxico para otras. Los criterios para establecer si o no un metal pesado es esencial para el crecimiento normal de plantas y/o los animales incluyen:

·         el organismo no puede crecer ni puede completar su ciclo biológico sin un suministro adecuado del metal.

·         el metal no puede ser totalmente remplazado por otro metal.

·         el metal tiene una influencia directa en el organismo y está involucrado en su metabolismo.

Además de C, H, O, N, P, K y S, los elementos que se ha demostrado que son esenciales para los vegetales son: Al, B, Br, Ca, Cl, Co, Cu, F, I, K, Mg, Mn, Mo, Na, Ni, Rb, Si, Ti, V, Zn. Los oligoelementos esenciales que con más probabilidad pueden provocar problemas de deficiencia en vegetales son: B, Cu, Fe, Mn, Mo, Zn.

El carbono orgánico disuelto (DOC) y coloidal (COC) en el agua del mar pueden ser los factores clave en controlar el destino, transporte y biodisponibilidad de muchos metales y contaminantes orgánicos en ambientes marinos (Bruland et al., 1991; Honeyman y Santschi, 1992; Campbell et al., 1997). Sin embargo, todavía no está claro como el DOC del agua de mar aumenta la solubilidad de metales por complejación. El conocimiento de las interacciones de metales con la materia orgánica macromolecular y coloidal (COM) son importantes para entender la biogeoquímica marina de metales esenciales. Se ha visto que una fracción significativa de metales disueltos en agua de mar están asociados con COM (e.g. Greenamoyer y Moran, 1996; Sanudo-Wihelmy et al., 1996; Wen et al.)

Solubilidad de los metales en agua de mar

La solubilidad de los metales pesados en el agua de mar es interesante para estimar la concentración de los metales disueltos, las rutas de la toma biológica de los metales por los organismos marinos, su bioacumulación y su toxicidad.. La solubilidad de metales pesados en agua de mar está controlada por varios factores como pH, temperatura, salinidad, naturaleza de los aniones, etc